Práctica 6: . Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias.
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE MÉXICO
PROGRAMA EDUCATIVO DE
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA
GRUPO: 8210351
|
- Docente: Ernesto
Gerardo Mendoza González - Fecha: 5 de julio
de 2021 - Equipo 2: Muñoz Toledo
Romina Ordoñez
Reyes Rosario Resillas
Román Diana Lariza |
Introducción:
La identificación de microbios ensambla junta la disciplina de la
microbiología con el estudio de enfermedades infecciosas. Los métodos de
identificación microbiana segura y exacta tienen valores a una amplia gama de
campos científicos. En la presente practica teórica te presentaremos lo que son
las pruebas bioquímicas que consisten en distintos test químicos aplicados a
medios biológicos en los cuales es conocida su reacción, nos permiten
identificar distintos microorganismos presentes al igual que permiten
determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de
identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan
la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos
hasta unas pocas horas. Otras pruebas requieren para su lectura el crecimiento
del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h; a este grupo
pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o
aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia
dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el sustrato a
metabolizar. Se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia
o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica
completa en uno o más microorganismos. Son empleadas principalmente la
identificación y clasificación de bacterias y hongos, en la cual también te
explicaremos que hacer de manera correcta para su elaboración y les iremos
indicando paso a paso así como los materiales utilizados en esta práctica de
igual forma se les expondrán los resultados obtenidos a partir de su
realización derivado de ello se elaborara un análisis acerca de los resultados
así como profundizando más en estas y
finalmente se les presentara un
cuestionario para reforzar los nuevos conocimientos adquiridos con esta
práctica.
Objetivo
Aprender la utilización, importancia y los pasos a seguir para realizar
las pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias
Materiales y métodos
Materiales:
v Galería api 20e
v Parafina liquida
v Agua
v Cultivo bacteriano
v Mechero
v Portaobjetos
v Cloruro férrico
v Reactivo de kovac
v Koh
v Alfa naftol
v Ácido sulfanilico
v Alfa naftilamina
v Papel Api 20E de resultados
v Tubos de ensayo
Método:
Paso 1: Antes de la inoculación se les agregara agua a los alveolos de
la base de la galería retirando el exceso de agua
Paso 2: para realizar estas pruebas es primordial partir de un cultivo
puro de la bacteria a partir de él se harán las suspensiones de algunas
colonias de la bacteria en solución salina y se inoculara cada tubo con esta
suspensión.
Paso 3: todos los tubos se llenan hasta la base de la cúpula con las
siguientes excepciones en los llamados VP, GEL y CIT la
suspensión bacteriana también se añade a la cúpula
Paso 4: en el caso de los tubos ADH, LDC, ODC, H2S Y URE la cúpula se
rellena con parafina liquida para conseguir condiciones anóxicas en el tubo
Paso 5: finalmente taparemos la galería para evitar la evaporación y la
encubaremos en una estufa a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo ya se pueden leer las pruebas
Paso 6: algunas otras pruebas requieren un revelado de forma que una vez
incubada la galería es necesario añadir ciertos reactivos para leer la prueba
estas son:
Paso 7: TDA si la
bacteria tiene triptófano desaminasa tras añadir cloruro férrico recibirá una
coloración pardo-rojiza.
Paso 8: IND se
estudia si la bacteria degrada el triptófano con la producción de indol una vez
crecida la bacteria se añadirá reactivo de Kovac
Paso 9: UVP
añadir al cultivo unas gotas de KOH y de alfa naftol
Reducción de
nitratos
Paso 10: tubo GLU
se le añade al tubo una gota de ácido sulfanilico y otra de alfa naftilamina y
esperamos 3 minutos
Paso 11:
finalmente se rellenará el papel del Api 20E donde aparecen todas las pruebas
de las pruebas bioquímicas explicadas anteriormente
Se ordenan los
tripletes en los que tienen valores de 1, 2, 3 y 4, para cada triplete
tendremos un digito resultante de la suma de los valores de los tubos en los
que se ha obtenido un resultado positivo de modo que ira desde 0 todas las
pruebas negativas y 7 todas las pruebas positivas, se obtiene así un numero de
7 dígitos que buscaremos en un libro de claves que nos indicara a que especie
bacteriana pertenece la bacteria, así como la calidad de la determinación.
Resultados:
Después de la incubación por 24 hrs a 37°C se
pueden leer los resultados.
ONPG= presencia
de beta-galactosidasa, contiene ONPG que es incoloro, la enzima rompe esta
molécula generando producto de color amarillo. Amarillo positivo. Incoloro negativo.
ADH-LCD-ODC-URE=
Sí las bacterias presentan esas enzimas degradara los sustratos subiendo así su
pH. Amarillo negativo.
Rojo positivo.
CIT= Se investiga
la capacidad de la bacteria de crecer con citrato como única fuente de Carbono,
esto sube su pH. Azul
positivo. Verde pálido/ amarillo negativo.
H2O= si la
bacteria realiza respiración anaerobia utilizando el tiosulfato. Negro positivo. Incoloro
negativo.
GEL= La bacteria
puede realizar la gelatina. Negro
positivo. Incoloro negativo.
En una hoja API
20E aparecen las reacciones mencionadas anteriormente.
Para cada triplete de pruebas se tiene un dígito
resultante de la suma de los valores de los tubos en los que se ha obtenido un
resultado positivo, este valor oscilará entre 0 (pruebas negativas) y 7
(pruebas positivas)
Estos dígitos se
buscan en un libro el cual nos dice a qué especie bacteriana pertenece la
bacteria así como la calidad de la determinación.
En caso de no
haber tres pruebas positivas se incuba de nuevo la galería por 24hrs a 37°C
Discusión de resultados:
Esta prueba tuvo como finalidad la identificación de bacterias gram-negativas
mediante una galería Api 20E que sirve para la identificación de
enterobacterias y bacterias relacionadas, los tubos tienen un medio
deshidratado y en cada uno de los 20 tubos se realizaron una prueba bioquímica determinada. A partir de un cultivo puro de la bacteria se
realizó una suspensión de algunas colonias de la bacteria en solución salina,
cada tubo se inoculó con esta suspensión.
En todos los tubos se llenaron hasta la base de la cúpula, a excepción de unos
cuantos como en el caso del VP, GEL y CIT donde la suspensión bacteriana
también se añadió a la cúpula. En CIT se observó la capacidad de la bacteria de
crecer con citrato como única fuente de nitrato, el citrato ocasiona que el pH
suba provocando el cambio de color. La reacción es positiva cuando se torna de un
color azul, sí por el contrario es negativa se torna de un color verde pálido o
amarillo. En el tubo GEL se observó sí la bacteria puede realizar gelatina, su
degradación liberará un pigmento negro, en el caso negativo no se tornará negro.
En los tubos ADH, LDC, ODC, H2S y URE se rellenaron las cúpulas de los tubos
con parafina liquida para tener condiciones anoxicas, esto con el fin de ver sí
presenta alguna de estas enzimas: Arginina dihidrolasa, Lisina descarboxilasa,
Ornitina descarboxilasa o Ureasa; estas enzimas degradaran los diferentes
sustratos y esto provocará que el pH suba haciendo que el indicador se torne
color rojo, en caso de ser negativo presentará un color amarillo. En el caso de
H2S dónde también se uso parafina liquida en la cúpula se determino sí la
bacteria realiza respiración anaerobia dónde se uso como aceptor final de
electrones el Tiosulfato sódico que se encuentra en el medio y que generará un
precipitado negro, en caso de no presentarse significa que es negativo. En ONPG
dónde no se lleno la cúpula se buscó la presencia de la beta-galactosidasa, esta
enzima rompe la molécula de ONPG generando un color amarillo, por lo cual esta
significa que es positiva, en caso de no presentar el color amarillo significa
que es negativo. En los demás tubos, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y
ARA, se buscó sí la bacteria usa diferentes azucares, esto provocará que el
medio se acidifique de tal forma que el indicador de pH, azul de bromotimol, se
torne de color amarillo, el color azul o verde nos indica que es negativo.
También hubo otras pruebas que requirieron un revelado, en las cuales una vez incubadas
necesitaron reactivos para que se puedan leer, como fue en el caso del TDA
dónde se le añadió cloruro ferrico, en esta se busca sí la bacteria tiene
triptófano desaminasa, cuando toma un color pardo-rojiza significa que es
positivo, por el contrario, sí el color es amarillo o anaranjado es negativo.
En IND se le añadió el reactivo de Kovacs, en esta se busca sí la bacteria
degrada el triptófano con la producción de indol, después de 2 minutos se
presenta un anillo rojo en la cúpula significa que es positiva, sí es amarillo
significa que es negativo. En el caso del VP nos sirve para determinar sí la
bacteria lleva a cabo una fermentación del tipo gutinel gintolica, cuando se le
añade al cultivo unas gotas de koh y de alfa naftol y luego de diez minutos
toma un color rojo que significa que la reacción es positiva.
En la prueba GLU se busca que la bacteria tiene enzima nitrato reductasa que
produce nitrito, para esto se le añadió una gota de ácido sulfanirico y otra de
alfa naftilamina, después de 2 minutos se tonará de color rojo dándonos a
entender que tiene nitrato reductasa, sí la prueba permanece amarillo la prueba
sería negativa lo cual significa que no hay nitrito en el medio, en este caso
también se tiene que comprobar que la bacteria tiene nitrato y nitrito
reductasa y que en consecuencia el nitrato pase a nitrógeno molecular o que por
el contrario careciera de ambas enzimas. Para esto se añadió polvo de zinc que
reduce químicamente el nitrato a nitrito y después de 10 minutos se observan
los resultados, sí el tubo permanece amarillo indica una reacción positiva, es
decir que hay nitrógeno molecular (las dos enzimas), sí el tubo se vuelve de
color rojo es negativo la prueba no contiene las enzimas.
Finalmente, se
rellenó el papel Api20E con los resultados obtenidos en las pruebas, se ordenaron
por tripletes y al finalizar se suman los valores positivos esto nos dio un numero
de 7 dígitos que se busco en un libro de claves en donde se nos indicó que
especie bacteriana pertenece la bacteria y también la calidad de la
determinación.
Conclusiones:
La detección
e identificación de estos microorganismos permite inferir sobre la
diversidad poblacional en la muestra analizada o el estado de salud del
consumidor. Por otro lado, este conocimiento puede ofrecer, el aprovechamiento
de cepas o de metabolitos microbianos en procesos biotecnológicos. Las pruebas
bioquímicas son utilizadas para analizar las bacterias presentes en una
colonia. Esto se lleva a cabo con distintas pruebas bioquímicas que tienen
distintos parámetros y con las que se obtienen distintos resultados. En base a
los resultados de una serie de pruebas bioquímicas se puede “deducir” la
bacteria de la que se conforma una cierta colonia. Para que las pruebas den
resultados satisfactorios se debe inocular en ellas de una manera adecuada, y
se debe buscar que la posible contaminación de las pruebas sea lo más mínima
posible. Otro aspecto de las bacterias inoculas en las pruebas bioquímicas que
se puede deducir en base a su crecimiento en ellas es que tipo de respiración
presentan. El inconveniente de estas pruebas de identificación fenotípica es
que los resultados erróneos en las pruebas pueden conducirnos a una
identificación equivocada, perdiendo tiempo y recursos y llevándonos a un
resultado erróneo.
Las pruebas
bioquímicas para identificación de microorganismos, así como las pruebas de
sensibilidad antimicrobiana adquieren gran importancia clínica, ya que permiten
identificar el microorganismo causante de las patologías en el paciente, así
como seleccionar el antibiótico adecuado de acuerdo con su capacidad de
inhibición bacteriana y el metabolismo del microorganismo causante de la
enfermedad.
Preguntas:
¿Qué son
enterobacterias?
Las enterobacterias constituyen una familia grande y
diversa de bacilos gramnegativos, que pertenecen tanto a las formas de vida
libre como a la flora normal de seres humanos y animales. Unas cuantas están
adaptadas estrictamente a humanos. Las enterobacterias crecen con rapidez bajo
condiciones aerobias o anaerobias y tienen actividad metabólica.
¿Qué es una prueba bioquímica?
Las pruebas bioquímicas permiten
determinar las características metabólicas de las bacterias objeto de
identificación. Algunas de estas pruebas son técnicas rápidas, ya que evalúan
la presencia de una enzima preformada y su lectura varía entre unos segundos
hasta unas pocas horas.
¿Para qué se usa la parafina líquida?
La vaselina esterilizada (parafina
líquida) se utiliza sobre todo en microbiología como vehículo para
mejorar los medios de cultivo anaerobios como: O/F, descarboxilasa, MIO, etc.
¿Qué significa ONPG?
La prueba ONPG es una práctica que
realicé en la asignatura de microbiología clínica.
Durante el segundo curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico
¿Qué son los citratos?
Sal del ácido cítrico. Es el primer compuesto intermedio
del ciclo de Krebs, formado por la condensación entre el acetil-CoA y el
oxalacetato.
Tiene facilidad para salir de la mitocondria y actuar, en
el citoplasma, como precursor de acetil-CoA, necesario para la síntesis de
ácidos grasos.
¿Qué es una óxidosa?
Una oxidasa es una enzima que cataliza
una reacción de oxidación/reducción empleando oxígeno molecular (O2)
como aceptor de electrones. En estas reacciones el oxígeno se reduce a agua (H2O)
o a peróxido de hidrógeno (H2O2). Las oxidadas son una subclase
de las oxidorreductasas.
Referencias:
Autor desconocido, McGraw Hill
Medical, Sherris microbiología, CAPÍTULO 33: ENTEROBACTERIAS. 2010, recuperado:
5-07-21
https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=2169§ionid=162984036
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