Práctica 1: método de tinción de gram

 UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE MÉXICO 

 

PROGRAMA EDUCATIVO DE 

INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

 

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA

GRUPO: 8210351

 

- Practica número 1. Método de tinción de Gram

  

- Docente:

   Ernesto Gerardo Mendoza Gonzalez

  

- Fecha:

   25 de mayo del 2021

- Equipo: 

  Muñoz Toledo Romina

  Ordoñez Reyes Rosario

  Resillas Román Diana Lariza

 

 

 Introducción

La principal dificultad a la hora de analizar a las bacterias es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes, es por eso por lo que en la presente practica teórica les mostraremos como es que se realiza la tinción de gram, así como los materiales a utilizar y los resultados y el análisis los resultados obtenidos de la práctica. Pero como primera instancia daremos una breve explicación, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrollo la técnica en 1884, y esta es una técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante (tinción) y que tiene una gran utilidad en medicina y que permite observar las bacterias mejor bajo el microscopio, es importante conocerla ya que nos ayuda en la taxonomía bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias. Basándose en su reacción, las bacterias pueden dividirse en dos grupos:  considerándose Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color morado, y bacteria Gram negativa a la que se visualiza de color rosa o grosella, las  Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista la decoloración a diferencia a las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede deshacer con la decoloración, este método es sencillo y nos puede responder varias preguntas es por eso que debemos aprender a utilizarlo claramente con las medidas de precaución que se necesitan.

Objetivo:

Aprender la utilización, importancia y los pasos a seguir para realizar el método de tinción de Gram 

Métodos y materiales 

Materiales:

• Agua

• Mechero

• Cristal violeta 

• Lugol 

• Alcohol de 96 grados 

• Safranina

• Muestra de un cultivo solido 

• Asa de siembra o material estéril para sembrar

• Portaobjetos

Método:

Paso 1: En primera instancia tenemos que hacer un frotis del microorganismo, para ello necesitamos colocar una gota de agua en un portaobjetos y sobre de ella colocaremos una extensión de una muestra de un cultivo sólido y lo dejaremos secar, puedes ayudarte con el mechero.

Paso 2: fijar las bacterias con calor, para ello pasar el portaobjetos por encima de la llama con la muestra hacia arriba 

Paso 3; añadir el cristal violeta y lo dejaremos un minuto para que tiña todas las bacterias grampositivas y gramnegativas 

Paso 4: lavar suavemente con agua y añadiremos Lugol y lo dejaremos actuar durante 30 segundos, este logra fijar el colorante 

Paso 5: nuevamente lavamos con agua y hacemos un tratamiento con alcohol de 96 grados durante 15 segundos para que se produzca la decoloración de las bacterias gramnegativas.

Paso 6: lavar con agua y realizar el tratamiento por separado ya que es importante para la tinción respetar los tiempos.

Paso 7: después de haber realizado lo anterior dicho en ambas muestras se debe colocar la safranina y la dejaremos actuar de 1 a 2 minutos para lograr teñir las bacterias gramnegativas.

Paso 8: finalmente lavar nuevamente con agua y la dejamos secar

Paso 9: ya puedes obsérvalas bajo el microscopio 

Resultados: 

Al terminar la experimentación se conoce que el último paso es añadir safranina para teñir las bacterias, lavar y dejar secar.

                                                                                                       Fig. 1

Después de este último paso se analizó en un microscopio óptico de 100 aumentos esta tinción con una gota de aceite de inmersión.

Fig. 2

Con las baterías gram negativas se observó que se tiñeron de un color rojo o rosa esto es debido a la safranina.

                                                                                                   Fig. 3

Mientras que las baterías gram positivas se tiñeron de un color violeta por el cristal violeta.

   

   Fig. 4

Resultados observados en el microscopio:

Mencionado anteriormente las bacterias teñidas de rosa o rojo serán gram negativas y las bacterias teñidas de violeta serán gram positivas.

Discusión de resultados:

En los resultados obtenidos podemos observar que se identificaron bacterias Gram positivas y Gram negativas. En cada portaobjetos se observó claramente que eran bacterias Gram positivas debido a que no se tiñeron de color azul o violeta si no que son de color rosado, esto se debe a que poseen una pared celular fina y una segunda membrana lipídica que hace que no se retenga el colorante cristal violeta dejándolas de color rosado debido a la Safranina y de igual forma se puede observar la forma de la bacteria para determinar su naturaleza. También se pudo observar que se encontraban bacterias Gram positivas en la muestra porque se tiñeron de color violeta y esto es debido a que poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano, las cuales retienen el colorante cristal violeta.

También se puede observar que sí se controlan los tiempos indicados y se siguen correctamente los pasos necesarios para llevar a cabo la práctica se podrá ver claramente las bacterias teñidas de su color correspondiente. Sí no se siguen correctamente puede provocar que la bacteria se vea afectada y haga que no se pueda observar correctamente sus características al ponerla bajo el microscopio, lo cual va a dificultar la distinción de las bacterias.  

En la fig. 4 se puede observar cómo se tiñeron las bacterias de color azul o rosado dependiendo sí son Gram positivas o Gram negativas, así como también se puede ver que tipo de Gram son, sí son Coco-Gram o Bacilos Gram negativos, Coco-Gram o Bacilos Gram positivos, se puede ver y determinar que tipo de bacteria es la que se tiene con lo cual se puede decir que concuerda con la investigación anteriormente hecha sobre este método de tinción.

Conclusiones

Al realizar esta práctica aprendimos a usar correctamente este método, a usar el equipo de laboratorio, en este caso del microscopio, los cuidados que se deben de tener con la muestra y tambien pudimos observar las diferencias que hay entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa haciendo uso del método de tinción Gram ya que este nos ayuda a que se puedan observar ciertos factores que son muy distintivos entre las bacterias como, por ejemplo: su color ya que unas se tiñeron de color morado o violeta (Gram positivas) y otras de color rosado (Gram negativas).

 En este caso se pudieron observar que los Gram negativos son bacilos y que también se encuentran Bacilos Gram positivo tintados con el color morado.

Al momento de preparar la muestra se debe tener cuidado como se maneja, ya sea por la cantidad de agua que coloquemos, la cantidad de tinta, el tiempo que tiene que quedarse entintándose y la temperatura ya que un calor excesivo estropearía la forma normal y la estructura de los microorganismos que se van a teñir, se tiene que controlar que el portaobjetos no se caliente demasiado.

Con esta práctica de laboratorio pudimos darnos cuenta de que el método de tinción Gram es eficaz para poder diferenciar a las Gram positivas de las Gram negativas, así como también se pudo observar la taxonomía bacteriana la cual es la que indica las diferencias fundamentales de la pared celular de las bacterias, aparte de que es sencillo de utilizar y da buenos resultados sí se ejecutan correctamente los pasos a seguir del método a emplear. 

Preguntas:

1. ¿Por qué es importante la tinción de Gram en la microbiología?

La tinción de Gram es de gran utilidad para realizar el examen directo de muestras clínicas, porque permite determinar la calidad de ellas, la respuesta inflamatoria, la naturaleza y cantidad de microorganismos presentes y el germen predominante en una infección mixta o con muestras contaminadas con biota normal.

2. ¿Cuál es la diferencia entre las bacterias de gram positivas y las bacterias de negativas?

La pared de las bacterias gram positivas están formadas por unas 40 capas de peptidoglicano que no permite que el alcohol pase a través de ella porque es muy espesa, mientras que las gram negativas estan formadas por una capa de peptidoglicano. 

3. ¿Por qué es importante el lugol para la realización de ambas baterías Gam?

El Lugol funge el papel de mordiente, impedirá la salida de cristal violeta mediante la formación de un complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del péptidoglicano presente en la pared bacteriana

4. ¿Qué es un mordiente? 

El término mordiente es aplicado a cualquier sustancia de origen natural o sintético que sirva para fijar el colorante a la fibra, de manera uniforme y estable al contacto con la luz y el agua

5. ¿Por qué las bacterias de tiñen de diferentes colores? 

Las bacterias Gram positivas y gram negativas se tiñen de forma distinta porque sus paredes celulares son diferentes. También causan diferentes tipos de infecciones, y hay distintos tipos de antibióticos eficaces contra ellas.

6. ¿En qué nos ayuda la safranina para la tinción de Gram? 

 se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram positivas y tiñe de rosa a las bacterias Gram negativas. 

Referencias:

González C. Roberto, Cuevas Briseida, Cartes Estefanía Marian, UNAM, FES Zaragoza, Noviembre 2020 Ciudad de México, México. 

Las funciones básicas en el laboratorio de microbiología: un enfoque más gráfico. Pp: 13,14,15, recuperado: 24-05-21

https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/Tinciones.pdf